淺談寡核苷酸類藥物非臨牀安全評價

自從上世紀九十年代首款寡核苷酸類藥物上市以來，已經陸續有十幾款核酸類藥物獲批，且在研核酸藥物數量呈爆發式增長。寡核苷酸類藥物的範圍比較廣，包括反義核酸(ASO)、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)等。對於這類藥物，除日本PMDA在2020年發佈過一篇寡核苷酸類藥物臨牀前安全性評價的指南，FDA則在2021年發過一篇“Nonclinical Testing of individualized antisense oligonucleotide drug products for severely delibitating or life-threatening diseases”，2024年11月，美國FDA發佈《Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics; Draft Guidance for Industry》，尚無其它特定的非臨牀研究指導原則出臺。雖然ICHS6中也有提到“the principles provided by the guidelines can also be applied to oligonucleotides”，但畢竟核酸類藥物是在細胞內發揮作用，還涉及化學修飾，與傳統生物技術藥物有很大不同，單純參考ICH S6是不夠的。好在已上市和在研核酸類藥物非常多，已經積累了足夠經驗，本文結合國內外公開發表的文獻，並主要參考日本PMDA指南，略作討論。

先看下寡核苷酸類藥物與生物藥、化藥的異同點。

寡核苷酸類藥物非臨牀安全性評價的目的與傳統化藥或者生物藥是一致的，評估藥物潛在的靶器官、劑量或暴露量依賴性、毒性的可逆性等。另外，很多指導原則比如ICH M3、ICH S6也是可以根據具體情況參考的。如果藥物治療威脅生命或比較嚴重且無治癒手段的適應症，比如晚期腫瘤，也可以參考ICH S9。寡核苷酸類藥物非臨牀安評策略更接近小分子化藥，同時也要兼顧下生物藥。

大部分寡核苷酸類藥物（ASO、siRNA、miRNA）通過與目標序列雜交發揮作用，有點類似單抗與受體的結合，稱之爲“on-target”（在靶毒性）作用，產生的不良反應主要來自藥理學作用的放大。如果與相似的非靶序列雜交，則會引起雜交依賴的脫靶毒性。因此，FDA建議在IND資料中需要體現採用BLAST或其他in silico或體外方法評估的雜交依賴的脫靶結合。既然有雜交依賴型，就有對應的非雜交依賴型，即由小核酸的結合、物理（如化學修飾）和化學性質引發的脫靶毒性。比如，PS骨架的ASO藥物會出現凝血時間延長、補體激活，而補體激活又會導致血壓降低。又如siRNA會刺激免疫激活。藥理學作用的放大和兩類脫靶毒性共同形成了寡核苷酸類藥物的毒性來源，如下圖所示。

動物種屬

與傳統化藥、生物藥要求類似，寡核苷酸類藥物也需要齧齒+非齧齒類兩種動物用於毒理學研究。其中，在靶毒性既然與藥理學作用放大相關，自然要求寡核苷酸類藥物在對應種屬中有藥理學活性。由於非人靈長類mRNA與人的同源性比較高，通常爲非齧齒類常用動物。不過，單個鹼基的錯配也會很大程度上影響核酸類藥物的活性，因此除了序列對比，最好還有些體外或者體內實驗數據支持在對應種屬中可產生藥理學活性，比如毒理研究中伴隨PD指標的考察。

如果齧齒類動物中沒有藥理學活性，則需要考慮採用替代分子或轉基因模型策略。核酸類藥物替代分子製備要比生物藥物更容易且成本更低，可以通過體外受體結合或功能試驗與臨牀候選分子做下對比。還有一點與生物藥有些區別，對於生物藥，根據ICHS6要求，如果短期重複給藥毒理試驗中，兩個種屬毒理表現類似，更長週期毒理研究中可以選擇其中一種種屬開展。這點對於寡核苷酸類藥物不適用，更長週期通常還是選用兩個種屬。

重複給藥毒性試驗設計

劑量選擇：PMDA認爲最高劑量選擇從兩個維度考量，在靶毒性角度要求達到最大藥理學作用。脫靶毒性則要求：1）最大耐受劑量（MTD）；2）暴露量飽和劑量；3）最大可行劑量（MFD）；4）臨牀擬用暴露量的50倍；5）1000mg/kg劑量，與ICH M3(R2)要求類似。通常設計3個劑量組以考察劑量-效應關係。

檢測指標：除常規毒理指標外，建議增加PD指標考察，以確定供試品在該動物種屬中產生了預期的藥理學作用。還有一點，寡核苷酸類藥物在體內並不是“雨露均沾”“均勻分佈”，大都以肝、腎蓄積的表現爲主，所以需重點關注下這兩個器官的毒性。另外，不同類別的寡核苷酸類藥物，有一些共同的毒性表現，可以參考同類藥物的毒理學研究背景數據。下表簡單羅列了常見寡核苷酸類藥物分類、結構、靶標、結合特點和作用機制。

給藥途徑和給藥頻率：給藥途徑採用臨牀擬用途徑。給藥頻率則要考慮臨牀PK特點。

研究週期：與ICH M3(R2)要求一致，通常最長給藥期限爲齧齒類給藥26 周、非齧齒類給藥39 周，可用於支持所有臨牀試驗和上市。同時也要考慮到寡核苷酸類藥物的一些特點，比如ASO類藥物血漿半衰期很短（<1h），但是在肝、腎組織中的半衰期卻可以長達14-30天。所以，很多ASO、siRNA每週或每月給藥一次的頻率即可維持藥效。因此，在給藥頻率、恢復期設置方面要將這些特殊性考慮在內。

可逆性：參考ICH M3(R2)和ICH M3_R2_Q&As。

開展節點：參考ICH M3(R2)。

代謝和降解產物：通常天然核酸分子被核酸酶降解，不存在安全性方面的擔憂。但是含化學修飾的代謝產物和降解產物則要按照ICH M3(R2)要求，開展非臨牀安全性評價，與傳統化藥要求一致。

雜質

寡核苷酸類藥物的雜質主要分爲寡核苷酸有關物質、有機小分子雜質、殘留溶劑和元素類雜質。

有關物質由於可能與寡核苷酸藥物具備相似的理化特性，需根據原料藥或製劑安評結果，考慮有關物質在其中發揮的作用。當然，如果有關物質水平非常低，則無需考慮。

小分子雜質可以參考ICH Q3A和Q3B。殘留溶劑可以參考ICH Q3C。元素類雜質則參考ICH Q3D(R1)。

藥物遞送系統/製劑

如果藥物涉及偶聯和脂質體，則需要採用製劑開展安全性評價，並需要考慮載體材料如蛋白、脂質、糖等對安全性的影響。

毒代動力學和藥代動力學

需要根據ICH S3A要求檢測系統暴露量。

安全藥理研究

對於系統給藥的核酸類藥物，參照ICH S7A考察對中樞神經系統、心血管系統和呼吸系統的影響，但通常不需要單獨開展。對於通過肝臟代謝、腎臟排泄的小核酸藥物，安全藥理試驗中建議補充肝臟和腎臟安全藥理試驗。如果藥物直接被遞送至中樞神經系統，如鞘內給藥，則僅開展以中樞神經系統爲終點的安全藥理研究即可。如果藥物既不是系統給藥，也不是顱內給藥，僅局部給藥局部發揮作用，如玻璃體內注射給藥，FDA認爲可不開展安全藥理學研究。

考慮到寡核苷酸類藥物不太可能對離子通道造成影響，FDA和PMDA相關指南均認爲理論上不需要開展hERG試驗。不過，很多已上市寡核苷酸類藥物還是開展了hERG這項研究。

單次給藥毒性試驗

ICH M3(R2)和ICH S6(R1)對單次給藥毒性試驗的要求同樣適用於寡核苷酸類藥物，不建議單獨開展此項研究，可以從劑量探索試驗、藥理學試驗或重複給藥毒理研究中獲得數據。

遺傳毒性研究

大部分寡核苷酸類藥物是基於Watson–Crick鹼基互補配對原則與mRNA相互作用。其它類型寡核苷酸如核酸適配體，也不會與核酸發生直接作用。因此，與基因治療不同，寡核苷酸類藥物不會整合進基因組，也不會對DNA造成影響。比如EMA就出過一個文件，“CHMP SWP Reflection Paper on the Assessment of the Genotoxic Potential of Antisense Oligodeoxynucleotides”，其中指出phosphorothioate nucleotides (as potential degradation products/metabolites from the PS oligodeoxynucleotides) are unlikely to pose a genotoxic hazard via incorporation into newly synthesized DNA. 所以諸如PS修飾的ASO類藥物理論上不用開展遺傳毒性研究。但FDA並未見類似意見出臺。PMDA則認爲天然核酸類藥物不需要開展遺傳毒性研究。不過，有化學修飾的核酸藥物則需要參照ICH S2(R1)開展研究，常見組合是細菌回覆突變實驗+哺乳動物細胞染色體畸變實驗或小鼠淋巴瘤Tk基因突變實驗+體內微核實驗或染色體畸變實驗，與化藥要求類似。也有文獻提到，對於研究比較充分的化學修飾，可以考慮僅開展體內遺傳毒性試驗，而不是標準組合研究，不過這種策略事先最好還是先與監管機構溝通確認一下。目前，未發現寡核苷酸類藥物有遺傳毒性的先例。

生殖毒性研究

可參照ICH S5(R3)開展分段式生殖毒性試驗。通常採用齧齒類動物開展生育力研究。齧齒類和兔開展胚胎-胎仔發育毒性試驗。當齧齒類和兔不是相關種屬時，可以考慮採用替代分子開展研究，不建議採用非人靈長類進行試驗。證據權重分析對於核酸類藥物也是適用的，如果生殖風險比較明確，也不需要開展額外的非臨牀生殖毒性研究。

致癌性試驗

參照ICH S1A、S1B和S1C。如果從藥物作用機制或重複給藥毒性試驗結果、遺傳毒性結果、雜交依賴的脫靶毒性結果等提示有致癌風險，則需要謹慎考慮臨牀獲益和風險，及致癌試驗策略。通常組合是大鼠2年+轉基因小鼠6個月致癌性研究。

局部耐受性

考慮伴隨重複給藥毒性試驗進行，不需單獨開展。

免疫毒性和免疫原性研究

免疫毒性參照ICH S8，通常不建議單獨開展，可伴隨在重複給藥毒性試驗中考察。可以考慮開展體外在人全血或PBMC中的促炎作用考察。

因寡核苷酸類藥物也具有部分生物藥的性質，需考察免疫原性風險，可參照生物藥要求建立檢測方法，伴隨在重複給藥毒性試驗中考察。

光毒性研究

如果有光安全性擔憂，可參照ICH S10進行。