重磅新作首發：寡核苷酸藥物非臨牀安全性評價的一般考慮及案例分析
[摘要]作爲一種新興的治療方法，寡核苷酸藥物（ ONTs ）在罕見病和某些慢性疾病領域展現出了良好的應用前景和開發潛力。目前，全球範圍內已有 20 種 ONTs 上市，主要包括反義寡核苷酸（ ASO ）、小干擾 RNA （ siRNA ）和適配體（ Aptamer ）等，並有越來越多的 ONTs 進入臨牀開發階段。業界已對 ONTs 的序列設計、化學修飾和遞送系統等積累了較多的經驗，但對於非臨牀安全性評價尚缺乏系統認識，也尚未形成全球監管的一致要求。本文系統調研了 ONTs 的主要毒性來源及其影響因素，以及美國食品藥品監督管理局（ FDA ）已批准上市的 ASO 和 siRNA 藥物研究案例，在此基礎上闡述了 ONTs 非臨牀安全性評價的研究內容、關注要點的一般考慮，以期爲我國 ONTs 的研發提供參考。
[關鍵詞]寡核苷酸藥物；非臨牀；安全性評價；一般考慮
[中圖分類號]R95[文獻標誌碼]C[文章編號]
[基金項目]202205009
General Considerations and Case Analysis of Non-clinical Studies of Oligonucleotide Therapeutics
FENG Zheng 1 , YUE Yan 1 , LI De-li 1 , LIU Qi-yao 1 , FAN A-li 1 , Huang Fang-hua2 * , GONG Xin-jiang1 *
（ 1, TriApex Laboratories Co., Ltd, Nanjing 211800, China, 2, Center for Drug Evaluation, NMPA, Beijing 100022, China ）
[Abstract] As an emerging therapeutic approach, oligonucleotide therapeutics (ONTs) have shown good application prospects and development potential in the fields of rare diseases and some chronic diseases. At present, 20 ONTs have been approved globally, mainly including antisense oligonucleotides (ASO), small interfering RNAs (siRNA), and aptamer, with more and more ONTs entering the clinical development stage. The industry has accumulated relatively rich experience in ONTs sequence design, chemical modification, delivery system, etc., but there is still a lack of systematic understanding of non-clinical safety evaluation, and no consistent global regulatory requirements have been formed yet. This article comprehensively investigates the main sources of toxicity of ONTs and their causing factors, as well as the non-clinical experiences of FDA-approved ASO and siRNA drugs, and elaborates the research contents and general considerations of ONTs non-clinical safety evaluation, in order to provide reference for the research and development of ONTs in China.
[Keywords] Oligonucleotide therapeutics; non-clinical study; safety assessment; general considerations
寡核苷酸藥物（ oligonucleotide therapeutics ， ONTs ）通常由 20~60 個核苷酸組成，主要包括反義寡核苷酸（ antisense oligonucleotide ， ASO ）、小干擾 RNA （ small interfering RNA ， siRNA ）和適配體（ Aptamer ）等 [ 1 ] 。作爲一種新興的治療手段， ONTs 不僅在罕見病領域展現出良好的應用前景，在其他慢性疾病治療領域（如高血壓和高血脂等）也顯示出巨大的開發潛力 [ 2 , 3 ] 。截至 2024 年 1 月，全球範圍內已有 20 種 ONTs 獲批上市，並有越來越多的 ONTs 進入臨牀開發階段 [ 4 ] 。近年來， ONTs 在合成工藝方面取得的重大突破也爲新的 ONTs 的研發創造了契機。業界已對 ONTs 的序列設計、化學修飾和遞送系統等積累了較多的經驗，但對於非臨牀安全性評價尚缺乏系統認識，包括研究策略、研究內容和關注點等。
目前，國際上尚未形成統一的用於指導 ONTs 研發和評價的指導原則。僅日本藥品和醫療器械管理局（ PMDA ）於 2020 年 3 月發佈了《 ONTs 的臨牀前安全性評價指導原則》 [ 5 ] （下文稱日本指導原則）。 2024 年 11 月，美國 FDA 發佈了《 Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics 》草案，目前正在徵求意見。國際人用藥品註冊技術協調會（ The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH ）也啓動了與該主題相關指導原則的起草工作。我國尚未發佈相關指導原則。本文系統調研了 ONTs 的主要毒性來源及其影響因素，以及美國食品藥品監督管理局（ FDA ） 已批准的 ASO 和 siRNA 藥物的研究案例，並對 ONTs 非臨牀安全性評價的策略、研究內容和關注點進行了概述 ，以期爲我國 ONTs 的研發提供參考。
1. ONTs主要毒性來源和影響因素
ONTs 的主要毒性分爲兩類，即基於 Watson-Crick 互補配對原則的雜交依賴型毒性和基於化學結構、理化性質和遞送載體的雜交非依賴型毒性 [ 6 ] 。雜交依賴型毒性又分爲在靶毒性和脫靶毒性，前者由 ONTs 藥理學作用的放大引起，後者由 ONTs 與靶 mRNA 序列相似的轉錄本雜交而產生 [ 7 ] 。雜交非依賴型毒性不依賴於雜交，主要包括補體激活、血小板減少、凝血抑制、免疫刺激和高暴露器官的毒性反應 [ 6 , 8 , 9 ] 。
未經化學修飾的寡核苷酸易被廣泛存在於細胞外和細胞內環境中的核酸酶降解，與血漿蛋白結合的能力較弱，經腎小球濾過後可被迅速清除，導致其在血漿中的半衰期較短，不利於靶組織分佈和藥效發揮 [ 10 , 11 ] 。研究表明，化學修飾如硫代磷酸酯（ PS ）、 2'-O- 甲氧基乙基（ MOE ）可提高寡核苷酸對核酸酶的抗性，增強與血漿蛋白的結合，延長在血漿中的半衰期 [ 12 ] 。因此，與未經修飾的寡核苷酸相比，修飾後的寡核苷酸具有更好的藥代動力學和組織分佈特徵，但也可能帶來新的毒性。
此外，給藥途徑和遞送載體也是影響 ONTs 毒性的重要因素。經脂質納米顆粒（ Lipid Nanoparticle ， LNP ）遞送或 N- 乙酰氨基半乳糖（ N-acetylgalactosamine, GalNAc ）偶聯的 siRNA 能夠實現對肝臟等臟器的高效遞送，同時由於在這些組織中的暴露量較高、半衰期相對較長，導致聚集並引起相關毒性反應 [ 13 ] 。
2. 已上市ONTs安全性特徵
2.1已上市ONTs基本信息概述
截至 2024 年 1 月，全球範圍內已經批准了 20 種 ONTs 上市（表 1 ） ，其中 ASO 和 siRNA 佔大多數，主要通過反義機制和適配體機制發揮藥理作用。
表1 已批准上市的ONTs基本信息彙總
通用名
商品名
上市時間
藥物類型
靶點
臨牀適應症
給藥途徑
Fomivirsen
Vitravene
1998
ASO
CMV
鉅細胞病毒視網膜炎
ivt
Pegaptanib
Macugen
2004
Aptamer
VEGF
黃斑變性
ivt
Mipomersen
Kynamro
2013
ASO
ApoB
IIa型高脂蛋白血癥
sc
Eteplirsen
ExONTys 51
2016
ASO
Exon51
杜氏肌營養不良症
iv
Nusinersen
Spinraza
2016
ASO
SMN2
脊髓性肌萎縮症
itt
Defibrotide
Defitelio
2016
Oligonucleotide
PAI-1+tPA+ vWF
肝靜脈閉塞性疾病
iv
Inotersen
Tegsedi
2018
ASO
TTR
遺傳性轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性
sc
Patisiran
Onpattro
2018
siRNA
TTR
遺傳性轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性
iv
Volanesorsena
Waylivra
2019
ASO
ApoC3
I型高脂蛋白血癥
sc
Golodirsen
VyONTys 53
2019
ASO
Exon53
杜氏肌營養不良症
iv
Givosiran
Givlaari
2019
siRNA
ALAS1
急性肝卟啉症
sc
Viltolarsen
Viltepso
2020
ASO
Exon53
杜氏肌營養不良症
iv
Inclisiran
Leqvio
2020
siRNA
PCSK9
原發性高膽固醇血癥或混合性血脂異常
sc
Casimersen
AmONTys 45
2021
ASO
Exon45
杜氏肌營養不良症
iv
Lumasiran
Oxlumo
2021
siRNA
HAO1
原發性高草酸尿症1型
sc
Vutrisiran
AMVUTTRA
2022
siRNA
TTR
遺傳性轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性
sc
Tofersen
QALSODY
2023
ASO
SOD1
肌萎縮性脊髓側索硬化症（ALS）
itt
Avacincaptad pegol
Izervay
2023
Aptamer
C5
地圖樣萎縮
ivt
Nedosiran
Rivfloza
2023
siRNA
LDH
原發性高尿酸血癥
sc
Eplontersen
Wainua
2023
ASO
TTR
遺傳性轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性
sc
注：“*”表示僅獲得EMA批准上市。ivt，玻璃體注射；itt，鞘內注射（intrathecal）。
CMV，鉅細胞病毒；VEGF，血管內皮生長因子；ApoB，載脂蛋白B；Exon，外顯子；SMN2，運動神經元存活蛋白2；PAI-1，纖溶酶原激活物抑制劑-1；tPA，組織型纖溶酶原激活劑；vWF，血管性血友病因子；TTR，轉甲狀腺素蛋白；ApoC3，載脂蛋白C3；ALAS1，5'-氨基乙酰丙酸合酶1；PCSK9，前蛋白轉化酶枯草溶菌素9；HAO1，羥基酸氧化酶1；SOD1，超氧化物歧化酶1；C5，補體蛋白C5；LDH，乳酸脫氫酶。
2.2已上市ONTs非臨牀和臨牀安全性研究結果及相關性分析
根據 FDA 審評報告和說明書，本文對 FDA 已批准上市的 ONTs 非臨牀毒性表現和臨牀常見不良反應進行了彙總（見表 2 ）。 ONTs 在非臨牀研究中常見注射部位和高暴露器官的毒性反應，主要表現爲注射部位反應、肝臟和腎臟嗜鹼性顆粒聚集和空泡化等；並可見藥理學相關指標的改變。研究表明，嗜鹼性顆粒聚集是寡核苷酸被遞送到高暴露器官後，分佈到具有吞噬活性的細胞（如肝枯否細胞和腎臟近曲小管上皮細胞）中，經蘇木精染色後在顯微鏡下的表現 [ 14 ] ，免疫組化和電鏡觀察對該結果進行了確認 [ 13 ] ；各種大小的空泡與嗜鹼性顆粒聚集通常發生在胞漿的同一區域，推測空泡的形成與溶酶體中局部高濃度的寡核苷酸引起的滲透不平衡所導致的膜結合的溶質聚集物膨脹有關 [ 15 ] 。
表２ 已上市的部分ONTs非臨牀毒性表現和臨牀常見不良反應
臨牀試驗中常見的不良反應包括注射部位反應、輸液相關反應、肝損傷和腎臟毒性等。通過比較這些 ONTs 的非臨牀毒性表現和臨牀常見不良反應發現，非臨牀研究較好地預測了多數已批准 ONTs 出現的臨牀不良反應。如經玻璃體注射（ ivt ）的 Fomivirsen 在非臨牀和臨牀研究中均可見眼部炎症； Inotersen 在動物和人體中均可見明顯的血小板減少； Nusinersen 在非臨牀研究中可見神經元病變，在臨牀試驗出現頭痛等不良反應等。值得關注的是，由於非臨牀安全性試驗中所採用的是健康動物且檢測手段有限，某些可能在患者中出現的不良反應較難通過動物模型進行預測，需要在臨牀試驗中進一步評估。
綜上，ONTs的非臨牀安全性評價包括對在靶毒性和脫靶毒性的考察，可以對臨牀不良反應的可能性和風險程度進行預測。
3. ONTs非臨牀安全性評價研究策略
與其他藥物一樣，非臨牀安全性研究貫穿於ONTs藥物研發的全生命週期。早期發現階段進行脫靶效應評估有助於確定成藥性好的臨牀前候選分子；開發階段進行系統的非臨牀安全性評價對於優化製劑處方、指導臨牀給藥方案的制定、識別臨牀不良反應或風險具有重要價值，並有助於提高臨牀試驗申請成功率[7]。因此，制定合理的非臨牀研究策略至關重要。
3.1早期發現階段進行多層級脫靶效應評估,見圖1
ONTs技術具有廣闊的應用前景，但同時也存在一定的脫靶風險，如免疫刺激反應、血小板減少、肝臟和腎臟毒性等。爲在早期發現階段對可能的脫靶毒性進行評價，相關領域專家結合目前ASO的研究現狀和趨勢提出了一套系統的候選分子多層級脫靶效應評估策略[6]。本文參考上述思路並基於筆者的研究經驗總結了在早期發現階段對不同類型的ONTs候選分子（主要爲ASO和siRNA）進行脫靶風險評估的策略。
首先，利用生物信息學工具從全轉錄組中預測可能與候選分子發生雜交的非目標序列，評估其潛在脫靶風險或篩選出特異性高的候選分子；對於存在與非目標序列發生雜交的候選分子，通過體外試驗比較該分子與目標序列和非目標序列的活性差異並確立安全活性窗口；對安全活性窗口較窄的分子進行更全面的風險評估，結合非目標序列的表達水平、生物學功能等評估脫靶效應可能產生的影響，並在後續的動物實驗中進行進一步的脫靶風險評估
此外，除了雜交依賴型脫靶毒性外，序列或化 學修飾相關的雜交非依賴型毒性也是值得關注的內容。例如， ASO 藥物的 PS 修飾本身可刺激免疫和激活補體，而中性骨架則沒有這種效應；凝血時間延長和血小板減少等毒性與化學修飾關係不大，更多與核苷酸序列本身相關；高親和力化學修飾，如鎖核酸（ locked nucleic acid, LNA ）更容易導致肝臟和腎臟的亞急性毒性。因此，在篩選策略上，應該根據候選分子的化學修飾和設計，優先評估與之最相關的潛在脫靶毒性。
3.2開發階段開展系統非臨牀研究
對於 ONTs ，非臨牀研究的核心目標是全面瞭解其安全性特徵，以支持臨牀開發和上市。建議參考 ICH S6 （ R1 ）開展在靶毒性評價；對於脫靶毒性，建議採用生物信息學和人源細胞體外基因表達分析評估雜交依賴型脫靶毒性，參考化學藥物的方法評價雜交非依賴型脫靶毒性。非臨牀評價除了常見的考慮因素（如相關種屬選擇、給藥途徑和劑量 / 暴露量）外，還應關注藥理學放大效應和替代分子的應用，毒理學研究需要根據相關適應症或擬定的給藥方案進行設計。
目前，我國尚無專門針對 ONTs 非臨牀研究的指導原則，可參考 ICH M3(R2) 等指南並結合 ONTs 產品特點開展必要的毒性試驗。一般來說，對 ONTs 的監管經驗與化學藥物相似，主要包括安全藥理學、一般毒理學、遺傳毒性、生殖毒性、致癌性試驗及其他與產品特性相關的毒性試驗等。由於 ONTs 具有某些治療用生物製品的特徵， ICH S6 （ R1 ）中的某些建議有助於指導非臨牀研究的開展。實際試驗中，應根據 ONTs 的序列、化學修飾和製劑處方制定具體的非臨牀研究策略。此外，對於動物種屬的選擇是該類藥物非臨牀研究的重要內容，將在第 4 部分進行詳述。
4. 非臨牀安全性評價研究內容和關注點 4.1動物種屬的選擇
根據上文所述， ONTs 的毒性分爲在靶毒性和脫靶毒性。爲了全面評價脫靶毒性，建議採用齧齒類和非齧齒類 2 種動物種屬；這 2 種動物種屬中至少有 1 種具有藥理學活性，以便對在靶毒性進行評價 [ 5 ] 。根據實際案例以及日本指導原則，當無藥理學相關種屬時，可僅在 1 種動物種屬中使用替代分子評價在靶毒性 [ 5 ] 。與替代分子相關的毒理學表現通常包括在靶效應、雜交依賴型和雜交非依賴型脫靶效應。由於序列不同於臨牀分子，替代分子脫靶效應不代表臨牀分子的安全性，應注意區分替代分子的在靶毒性和脫靶毒性 [ 5 ] 。
表 3 對已上市 ONTs 非臨牀研究一般毒理學試驗所用動物種屬進行了彙總。這些藥物均在猴體內具有藥理學活性，在齧齒類動物中是否具有活性取決於其核苷酸序列。根據各自的藥理學活性特點，均採用至少 1 種相關種屬考察在靶毒性，同時選擇合適的動物種屬評估其脫靶毒性。如 Inotersen 和 Patisiran 僅在食蟹猴體內有藥理學活性，一般毒性試驗中選擇食蟹猴作爲相關種屬考察臨牀分子的在靶毒性，選擇齧齒類動物評估臨牀分子的脫靶毒性； Lumasiran 在齧齒類動物和猴體內均具有藥理學活性，選擇大鼠和食蟹猴考察了臨牀分子的毒性特徵，包括在靶毒性和脫靶毒性。
綜上， ONTs 非臨牀研究應兼顧在靶毒性和脫靶毒性的考察，選擇 2 種動物種屬，其中至少在 1 種動物種屬中具有藥理學活性。
表 3 已上市 ONTs 一般毒理學試驗動物種屬彙總
類別
通用名
給藥途徑
具有藥理學活性
動物種屬
一般毒理學試驗動物種屬
小鼠
大鼠
ASO
Fomivirsen
ivt
兔、猴
Mipomersen
sc
Eteplirsen
iv
Nusinersen
itt
Inotersen
sc
Volanesorsen
sc
Golodirsen
iv
大鼠、猴
Viltolarsen
iv
Casimersen
iv
Tofersen
itt
Eplontersen
sc
siRNA
Patisiran
iv
Givosiran
sc
大鼠、猴
Inclisiran
sc
大鼠、猴
Lumasiran
sc
齧齒類、猴
Vutrisiran
sc
Nedosiran
sc
4.2安全藥理學試驗
建議參考 ICH S7A 《人用藥物安全藥理學試驗指導原則》對重要生理功能（如心血管、呼吸和中樞神經系統）的非預期影響進行評價，通常情況下可考慮採用整合試驗的方式，而不是開展單獨的安全藥理學試驗。由於 ONTs 不太可能作用於 hERG 等離子通道，開展體外 hERG 試驗意義不大 [ 5 , 16 , 17 ] 。如果在研發過程中發現了體內心血管相關的風險，可能需要開展針對性的體外研究。
Eteplirsen 在相關試驗中可見對心血管和神經元的影響， Nusinersen 因廣泛分佈於脊髓和大腦，基於風險考慮，二者開展了單獨的安全藥理學試驗。 除 Fomivirsen 外，已 上市的所有 ASO 和 siRNA 均開展了安全藥理學試驗，但並非所有藥物均進行了 hERG 試驗（如 Givosiran 、 Inclisiran 、 Lumasiran 、 Vutrisiran 、 Fomivirsen 、 Nusinersen 、 Eplontersen 未開展該試驗）。
4.3單次給藥毒性試驗
日本指導原則中提及如果可從劑量遞增試驗、短期劑量範圍探索試驗、藥理學試驗或重複給藥毒性試驗中獲得急性毒性信息，可不開展單獨的單次給藥毒性試驗，這與 ICH M3 (R2) 中的建議一致。 ICH S6 (R1) 中也提到，作爲藥理學或動物模型有效性試驗的一部分，通過進行單次給藥毒性試驗可收集到劑量 - 反應關係的信息。
鑑於 ONTs 在組織中通常具有較長的半衰期，非臨牀研究中通常採用較長的給藥間隔。 Eteplirsen 、 Inotersen 、 Golodirsen 和 Lumasiran 等已上市藥物均未開展單次給藥毒性試驗，通過其它相關試驗對單次給藥毒性進行了評估。
4.4重複給藥毒性試驗
重複給藥毒性試驗重點評估 ONTs 在特定器官的蓄積情況和毒性反應。研究表明，一些經化學修飾、具有抗核酸酶活性的 ONTs ，長期給藥後可能會在特定組織如肝、腎等蓄積併產生毒性反應 [ 18 ] ，非臨牀研究中常見高暴露靶器官的毒性反應，如肝腎可見嗜鹼性顆粒聚集和空泡化等 [ 15 ] 。
大鼠經 sc 重複給予 Lumasiran ，在 20 、 50 和 200 mg·kg-1 劑量下均可見肝細胞輕微至重度空泡化，枯否細胞色素輕微增加和 / 或肝細胞輕度到中度核腫大，腎臟輕微至輕度嗜鹼性顆粒和 / 或少量腎小管細胞空泡化；上述肝臟和腎臟相關改變均爲非不良反應。綜合死亡率、臨牀觀察、體重、生化指標等各項指標，未見不良反應劑量（ NOAEL ）爲 200 mg·kg-1 。食蟹猴經 sc 重複給予 Lumasiran ， 30 mg·kg-1 劑量下可見鹼性磷酸酶輕微升高， 100 和 300 mg·kg-1 劑量下可見肝臟枯否細胞輕微嗜鹼性顆粒，由於程度較輕且未見對動物健康狀況的影響， NOAEL 爲 300 mg·kg-1 。與 Lumasiran 類似，其它已上市藥物的重複給藥毒性試驗至少採用 2 種動物種屬進行，通過臨牀病理學、組織病理學和毒代動力學檢測，考察在不同劑量下的毒性反應特徵和劑量 - 反應關係。
4.5遺傳毒性試驗
對於含化學修飾的 ONTs ，應參考 ICH S2 (R1) 進行遺傳毒性試驗。
由於 ASO 和 siRNA 藥物均進行了不同程度的化學修飾，故已上市藥物開展了遺傳毒性標準組合試驗。調研顯示，已上市 ONTs 在 Ames 、體外染色體畸變和體內微核試驗中均爲陰性結果。儘管如此，隨着更多新化學修飾方式的引入，尚不能忽視 ONTs 潛在的遺傳毒性風險。某些經降解後可整合入 DNA 的化學修飾寡核苷酸也可能具有遺傳毒性 [ 19 ] 。
4.6生殖毒性試驗
建議參考 ICH S5 (R3) 並結合適應症人羣進行 ONTs 的生殖毒性（ developmental and reproductive toxicity ， DART ）試驗。通常，採用齧齒類動物進行生育力與早期胚胎髮育毒性（ fertility and early embryonic development ， FEED ）試驗和圍產期發育毒性（ pre-and postnatal development ， PPND ）試驗，採用齧齒類和兔進行胚胎 - 胎仔發育毒性（ embryo fetal development ， EFD ）試驗。日本指導原則建議，當臨牀分子在齧齒類和兔中無藥理學活性時，推薦在齧齒類或兔中採用替代分子進行 EFD 試驗，不推薦在非人靈長類動物中進行 EFD 試驗 [6] 。如證據權重分析（如作用機制、基因修飾動物的表型數據、同類分子的類別效應等）結果提示供試品存在對生育力或妊娠結局有明顯的不利影響，足以提示存在生殖毒性風險，則不需要開展額外的 DART 試驗。關於 DART 試驗的時間安排，參考 ICH M3(R2) 。
表4對已上市ONTs DART試驗類型和所用動物種屬進行了彙總。Inotersen、Volanesorsen和Patisiran 等的相關種屬僅爲猴，均採用齧齒類動物開展了臨牀分子和替代分子的FEED和PPND試驗；除mipomersen、nusinersen、inotersen、volanesorsen、tofersen、patisiran、nedosiran 、givosiran、inclisiran、lumasiran和vutrisiran同時採用齧齒類和兔開展EFD試驗（mipomersen、nusinersen、inotersen、volanesorsen、tofersen和eplontersen採用 Ⅰ/II段生殖試驗組合的方式進行評價），其餘僅採用齧齒類開展EFD試驗。兔EFD試驗均採用了臨牀分子，主要目的可能在於用臨牀分子在第二個種屬中考察因脫靶毒性帶來的生殖毒性。考慮到杜氏肌營養不良症（DMD）患者主要爲男性，Eteplirsen、Golodirsen和Casimersen一般毒理學重複給藥中均未觀察到對雄性生殖系統的影響，故均未開展DART試驗。Viltolarsen的適應症也爲DMD，僅進行了雄性小鼠的FEED試驗。
4.7致癌性試驗
建議參考 ICH S1A 、 ICH S1B 和 ICH S1C (R2) 評估 ONTs 是否需要以及如何設計致癌性試驗。日本指導原則提出，當由於作用機制（如免疫抑制）存在致癌性擔憂，或遺傳毒性試驗、重複給藥毒性試驗或雜交依賴型脫靶毒性結果提示存在致癌性擔憂，則較難通過致癌性試驗排除這種擔憂，而是應該在考慮臨牀風險和獲益的情況下適當地傳達致癌性風險 [6] 。
表 5 對已上市 ONTs 致癌性試驗的完成情況進行了彙總。 Eteplirsen 、 Nusinersen 和 Lumasiran 等在提交上市申請（ NDA ）時未完成致癌性試驗，一方面是因爲現有的數據未提示致癌性風險，另一方面是結合臨牀獲益 - 風險評估認爲可將致癌性試驗可作爲上市後要求；由於 Inotersen 在肝臟和腎臟中存在高暴露， Patisiran 在雄性動物中可見細支氣管肺泡腺瘤，在 NDA 時完成了致癌性試驗，其中 Inotersen 採用了替代分子進行了評價。
4.8局部耐受性試驗
需評價品種製劑給藥的局部耐受性，可在重複給藥毒性試驗中伴隨，除非有單獨開展的理由。 FDA 批准上市的 ONTs 均在重複給藥毒性試驗中伴隨考察了對給藥部位的耐受性。
4.9免疫毒性試驗
某些類型的 ONTs 已知會激活先天免疫系統（如巨噬細胞、組織細胞、補體）。儘管通常無需開展專門的免疫毒性評估，但在一般毒性研究中評估 ONTs 誘導的免疫效應（如細胞因子、補體）可以提供有用的信息。可將免疫毒性試驗整合在重複給藥毒性等試驗中進行評價，相關要求參考 ICH S8 。
Eteplirsen 、 Nusinersen 、 Inotersen 和 Patisiran 在重複給藥毒性試驗中進行了免疫毒性試驗相關指標的檢測，如白細胞系相關指標（ Eteplirsen 和 Nusinersen ）、 C 反應蛋白（ Inotersen ） 、 α1 酸性糖蛋白（ Patisiran ）、免疫器官（淋巴結、胸腺、脾臟）組織病理學（ Patisiran ）、免疫細胞表型分析（ Eteplirsen 和 Inotersen ）等。
4.10光安全性評價
對於化學修飾的核酸如存在特殊的光安全性擔憂，應參考 ICH S10 進行評價。根據目前已上市產品的文獻資料，均未見光安全性相關評價，因此，光安全性評價建議具體情況具體分析。
4.11雜質限度的界定
ONTs 的雜質分爲寡核苷酸有關物質、有機小分子雜質、殘留溶劑和元素雜質。小分子雜質、殘留溶劑和元素雜質的評價參考 ICH Q3 和 ICH M7 ；由於理化性質相似，寡核苷酸有關物質通常難以單獨分離，較難參考 ICH Q3A 進行界定，因此對於該類雜質的安全性評價應基於原料藥或製劑的研究結果（如雜質譜、毒性譜等） [ 5 ] 。關於脫靶毒性的生物信息學分析可用於評估寡核苷酸有關物質的雜交依賴型脫靶毒性，如在生物信息學分析中包含了錯配序列，可以假定已對主要寡核苷酸有關物質的雜交依賴型脫靶效應進行了研究。如每種寡核苷酸有關物質的含量遠低於活性成分，則評價其雜交依賴型脫靶效應的意義不大 [ 5 ] 。對於 ONTs ，應儘可能在生產過程中減少雜質的產生，並根據藥學和非臨牀研究數據、文獻資料綜合評價在人體中的安全性。
在 Vutrisiran 的非臨牀研究中，共涉及 6 批樣品，其中 3 批含特定雜質（＞ 0.1% ）， NOAEL 劑量下的雜質水平支持了臨牀樣品雜質限度的制定。
4.12代謝產物和/或降解產物的安全性
研究顯示，天然核苷酸很容易經各種途徑清除，不太可能形成反應性中間體或破壞天然核苷酸儲庫和再循環途徑 [ 20 ] ；某些化學修飾，如 PS 和 MOE 不產生有毒代謝產物，這可減少對部分 ONTs 代謝產物的評價需求，而對於新的或不明確的化學修飾，可能需要進行更廣泛的代謝研究 [ 7 ] 。因此，對於可被核酸酶降解的天然核苷酸，其代謝產物或降解產物的安全性無需特別關注；但對於含有化學修飾的代謝產物和降解產物，需參考 ICH M3 (R2) 進行非臨牀安全性評價。
Givosiran 是通過將 GalNAc 配體與 siRNA 偶聯而實現肝臟特異性遞送的 siRNA 藥物，主要化學修飾爲 PS 骨架、 2'- 氟（ 2'F ）和 MOE 。試驗顯示， Givosiran 在不同種屬血清中的穩定性相似，正義鏈比反義鏈更穩定，主要的活性代謝產物爲 AS(N-1)3’ Givosiran 。大鼠（ 10 mg·kg-1 ）和猴（ 30 mg·kg-1 ）經 sc 給藥後，血漿中唯一活性代謝產物爲 AS(N-1)3’ Givosiran ，暴露量佔總物質的百分比分別約爲 17% 和 42% ；臨牀試驗中， Givosiran 以 2.5 mg·kg-1 每月一次 sc 給藥後，血漿中主要代謝產物爲 AS(N-1)3’ Givosiran ，穩態暴露量佔總物質的百分比約爲 33% 。在大鼠和猴重複給藥毒性試驗中， AS(N-1)3’ Givosiran 的系統暴露量顯著高於臨牀劑量下的暴露量（表 6 ）。因此，大鼠和猴重複給藥毒性試驗充分評價了活性代謝產物 AS(N-1)3’ Givosiran 的安全性 [ 21 ] 。
表 6 非臨牀和臨牀試驗中 Givosiran 主要代謝產物暴露情況彙總
種屬
主要代謝產物
佔總物質的百分比（%）
暴露量（ng·h/mL）
大鼠
AS(N-1)3’ Givosiran
17
626
AS(N-1)3’ Givosiran
42
AS(N-1)3’ Givosiran
33
1930
4.13針對遞送系統的評價
對於遞送系統製劑，評價 ONTs 最終制劑的安全性是非常重要的，特別是當採用了 LNP 等特殊遞送系統時。 ONTs 的遞送系統在很大程度上影響着其安全性和有效性，應根據風險等級和已有的信息，採用適當的毒性試驗評價 ONTs 載體材料（如蛋白質、脂質、糖等）的安全性 [ 5 ] 。
Patisiran 是第一個批准的 LNP 包裹的 siRNA 藥物， LNP 中含有 2 種新的成分（ DLin-MC3-DMA 和 PEG2000-C-DMG ）。針對該 LNP ，在支持 IND 和 NDA 的研究中分別進行了體外 hERG 試驗、一般毒理學試驗、體內微核試驗和生殖毒性試驗（表 7 ）。
5. 結語與展望
作爲一種新興的治療方法， ONTs 具有巨大的應用前景，有望在更多的罕見性疾病、心血管疾病、代謝性疾病、傳染性疾病和癌症領域展現出臨牀價值。 ONTs 的毒性取決於多種因素，如序列設計、化學修飾、給藥方案（給藥途徑、劑量、持續時間）等。最常見的改變是肝臟、腎臟等高暴露組織的病理學變化和免疫反應 [ 6 , 8 , 9 ] 。已上市產品的非臨牀研究較好地支持了臨牀試驗的開展，其非臨牀研究經驗爲新的 ONTs 的開發提供了參考。在深度彙總和解讀已上市藥物非臨牀研究案例的基礎上，本文根據國外監管機構和寡核苷酸安全工作組（ OSWG ）發佈的相關建議和共識文件 [ 22-24 ] ，對 ONTs 非臨牀安全性評價的策略和技術要點進行了闡述： 1 ）在早期開發階段，開展多層級脫靶效應評估，充分利用生物信息學和體外模型對候選序列進行篩選，評估其與非靶標序列發生互補配對的可能性。 2 ）在開發階段，分階段開展支持 IND 和 NDA 的一般毒理學試驗，並從兼顧在靶毒性和脫靶毒性評價的角度考慮非臨牀安全性評價試驗動物種屬的選擇；結合供試品結構特點、化學修飾和遞送載體開展相應的遺傳毒性、生殖毒性和致癌性試驗。 3 ）關注對代謝產物、雜質和 / 或降解產物的安全性評估。通過本文，期望爲國內 ONTs 研發提供參考和借鑑。
隨着對非編碼 RNA 的深入認識，預計未來將會有更多類型的 ONTs 進入臨牀試驗或上市。同時，需要考慮如何應對靶細胞遞送不足和脫靶效應等挑戰 [ 25 ] 。合理的序列設計、算法、化學修飾和遞送載體至關重要，減少脫靶效應和更深入地理解毒性機制有助於避免後期開發過程中的安全性問題，提高開發成功率。此外，新型體外模型的開發有助於提高預測性和敏感度。 非臨牀評價應在遵循指導原則的同時，結合具體產品的特點和臨牀適應症進行個性化考量。監管機構也在不斷積累和完善審評實踐，爲 ONTs 的研發提供良好的指引。
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