溶瘤病毒產品非臨牀研究考量及案例分享

2024年1月25日，溶瘤病毒生物科技公司CG Oncology在納斯達克上市，當天最高漲幅超過100%，市值超20億美元。溶瘤病毒再次吸引了醫藥工業界的目光。溶瘤病毒作爲一種新興腫瘤治療方式，可選擇性地感染腫瘤細胞和/或選擇性地在腫瘤細胞中複製以裂解腫瘤細胞，也可同時表達外源基因以提高相應功能，還可通過刺激機體產生免疫反應達到治療目的，對正常細胞不造成影響。

在20世紀的時候，研究人員主要利用天然病毒的溶瘤作用，但到了21世紀，開始了對溶瘤病毒的基因改造，賦予其更多能力，可以理解爲作爲“士兵”的溶瘤病毒裝備了各種 “尖端武器”。目前已經有4款溶瘤病毒類產品上市，2004年，Rigvir在拉脫維亞獲批用於黑色素瘤和其他惡性腫瘤的治療。2005年，H101在中國獲批用於鼻咽癌治療。2015年，T-VEC在美國獲批用於黑色素瘤的治療。2021年，Delytact在日本獲批上市用於惡性膠質瘤的治療。

溶瘤病毒的主要類型

溶瘤病毒產品包括野生的、減毒的、或經過基因修飾的具有複製能力的病毒產品。溶瘤病毒來自單鏈或雙鏈 DNA 或 RNA 病毒，其中單鏈 RNA （ ssRNA ）和雙鏈 DNA （ dsDNA ）較爲多見。 dsDNA 病毒主要包括腺病毒（ adenovirus ）、痘苗病毒（ vaccinia virus ）、皰疹病毒（ herpesvirus ）等。 ssRNA 病毒包括柯薩奇病毒（ coxsackievirus ）、塞內卡病毒（ Seneca Valley virus ）、脊髓灰質炎病毒（ poliovirus ）、麻疹病毒（ measles virus ）、新城疫病毒（ Newcastle Disease virus ）、水泡性口炎病毒（ vesicular stomatitis virus ）等。部分溶瘤病毒特徵如下圖所示。

除了天然野生型，還有一些是基因修飾型的溶瘤病毒。比如將腫瘤細胞過表達的抗原（如 CD20 、 EGFR 、 HER2 等）對應的抗體融合到溶瘤病毒中，增加腫瘤靶向性和選擇性，類似爲溶瘤病毒安裝了“ CAR ”。也有通過敲除某些基因，實現功能調節的目的，比如使病毒不能在正常細胞中複製。或者通過過表達某些基因如細胞因子、蛋白實現增強殺傷能力的目的。舉例如下表所示。

溶瘤病毒非臨牀評價指導原則

專門針對溶瘤病毒這一類產品的特定指導原則很少，有些基因治療的指導原則將部分類型的溶瘤病毒產品包括在內，還有些指導原則針對的是溶瘤病毒一部分特點，比如溶瘤產品的脫落研究。羅列如下：

1 ） ICH CONSIDERATIONS Oncolytic Viruses （ 2009.10 ）

2 ） ICH Considerations General Principles to Address Virus and Vector Shedding （ 2009.07 ）

3 ） ICH Considerations: General Principles to Address the Risk of Inadvertent Germline Integration of Gene Therapy Vectors （ 2006 ）

4 ） NMPA ：基因治療產品非臨牀研究與評價技術指導原則（適用範圍包括未通過基因修飾表達特定基因的微生物如溶瘤病毒產品）（ 2021.11 ）

5 ） ICH S12: Guideline on nonclinical biodistribution considerations for gene therapy products(CDE 網站有翻譯版 )

6 ） EMA ： Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products （ 2018.03 ）

7 ） EMA: Quality, non-clinical and clinical issues relating specifically to recombinant adeno-associated viral vectors （ 2010.06 ）

8 ） FDA: Guidance of industry: preclinical assessment of investigational cellular and gene therapy products （ 2013.11 ）

9 ） FDA: Design and analysis of shedding studies for virus or bacteria-based gene therapy and oncolytic products （ 2015.08 ）

10 ） PMDA: Guidance on quality and safety securing of pharmaceutical products for gene therapy(2013.07)

11 ） PMDA ： Law to maintain the diversity of Organisms through Control of the Use of Genetically-modified Organisms （ 2004.02 ）

當然，ICH M3（R2）、ICH S6和ICH S9等也可以適當參考。張素纔等老師發表的《溶瘤病毒類藥物非臨牀安全性評價的實踐與思考》也可參考。2015年上市的T-VEC和2021年上市的Delytact相關資料也是不錯的參考素材，本文會對這兩個案例做下分享。

溶瘤病毒類產品非臨牀評價具體技術要求

1、選擇性

選擇性屬於主要藥效學研究中的一部分。溶瘤病毒對腫瘤細胞的選擇性是這類產品需要特別關注的一個點。否則怎麼好意思叫“溶瘤病毒”呢。ICH規定，對正常細胞的潛在風險需要在人體試驗前評估。對溶瘤病毒來講，選擇性有着兩層含義，一是能選擇性感染腫瘤細胞，從而進入細胞內部；二是可以在腫瘤細胞中進行復制。故，需重點評估在腫瘤細胞系、非腫瘤正常細胞系中溶瘤病毒的細胞毒性、裂解能力和複製情況。需要注意的是因受體或啓動子原因，有些溶瘤病毒在永生細胞系和原代腫瘤細胞中的敏感性有差異，因此如果條件允許，適當採用原代腫瘤細胞進行評價是有必要的。如果實在沒有合適的體外感染體系用於評估選擇性，就只能伴隨在體內試驗中進行考察了。

2、動物模型

模型動物選擇時應考量溶瘤病毒的親嗜性、傳染性、複製能力、引起細胞病變的能力及抗腫瘤作用。這就對動物模型的選擇提出了很大挑戰。雖然荷瘤鼠可以用來進行溶瘤病毒的藥效概念驗證、藥代動力學研究、病毒脫落研究和安全性研究，但是溶瘤病毒在動物中的組織感染和複製能力與人體可能有區別。以常見的腺病毒爲例，雖然其可以感染異源移植到小鼠中的人體腫瘤細胞，但腺病毒不能在小鼠組織中複製，因此只能部分評估溶瘤病毒的作用。而且，異源移植的荷瘤鼠通常是免疫缺陷的，無法評估機體對溶瘤病毒的免疫反應。小鼠同源模型可以解決免疫缺陷的問題，但要看溶瘤病毒能否感染鼠源腫瘤細胞，併產生活性。

3、生物分佈

溶瘤病毒是具備複製能力的，因此需要考察其在正常組織感染和複製的能力，包括每個組織的感染滴度和/或病毒基因組水平。檢測方法儘可能靈敏，比如採用Q-PCR技術。如果病毒經過基因改造，改造後基因的表達情況也需要考察。如果可能，可以考慮在動物模型中開展，滿足同時考察在靶組織和非靶組織中分佈、脫落研究的目的。當然，無論選擇模型動物還是健康動物，都必須是生物學層面具備相關性的動物，這樣對於指導臨牀和後續毒理方案設計纔有意義。

根據ICH S12，基因治療產品生物分佈試驗收集的組織樣本或體液至少包括注射部位、性腺、腎上腺、大腦、脊髓（頸、胸、腰）、肝、腎、肺、心、脾和血液。根據產品類型、親嗜性、作用機制等不同，還可擴展到外周神經、背根神經節、腦脊液、玻璃體、引流淋巴結、骨髓、眼睛和視神經等。

ICH S12特別提到性腺組織的分佈，主要擔心病毒基因有整合進生殖細胞染色體的風險，或者會對生殖細胞基因組產生影響。涉及到生殖和遺傳這一敏感問題，如有分佈，具體可參考ICH Considerations: General Principles to Address the Risk of Inadvertent Germline Integration of Gene Therapy Vectors。

4、病毒脫落研究

溶瘤產品通過下述一種或所有途徑從患者體內釋放：排泄物（糞便）；分泌物（尿液、唾液、鼻咽液等）；或通過皮膚（膿包、傷處、傷口）。脫落不同於生物分佈，後者描述的是產品從給藥部分擴散至全身，後者描述的是產品從體內排泄或釋放。脫落增加了溶瘤病毒從經治個體向未經治個體傳播的可能性。雖然從感染性病毒中衍生的溶瘤病毒在研發過程中進行的改造會導致毒力衰減，脫落程度不及母株，但脫落的風險依然存在安全性擔憂。

常規採集的樣本是尿液、糞便和唾液。如果是皮內給藥途徑，建議額外採集注射部位的皮膚拭子。如果是吸入或經鼻內途徑給藥，則建議收集鼻咽洗液。

動物脫落數據應該在臨牀試驗之前開展，有助於預測人體可能的脫落規律。尤其是人類先前未曾暴露於這種產品，例如非人類細菌或病毒株；產品先前曾在人體中給藥，但是經過改造，其體內去向完全不同於母株；先前曾在人體給藥，但變更給藥途徑；未曾用於人體，且給藥途經不同於自然暴露/感染途徑等情況。

脫落試驗可以伴隨安全性或生物分佈試驗開展。

5、一般毒理研究

毒理設計的大原則，比如組別設計、動物數量、常規毒理指標等與其它類別生物製品類似，不再贅述，分享幾點溶瘤病毒這類產品需要額外關注的。

毒理研究設計時需要考慮溶瘤病毒在組織中的生物分佈及持續時間。如果是基因修飾病毒如轉基因（IL-2、GM-CSF等），還需要考量轉入目的基因的表達情況。如果目的基因，如GM-CSF，在小鼠體內沒有活性，可以考慮導入鼠源替代基因，製備替代分子，開展毒理研究。

選擇動物種屬時，需要考慮溶瘤病毒能否在該種屬中正常複製，並能產生預期的病理表現。如果選擇採用荷瘤鼠開展安全性評價，需要考慮到腫瘤體積對動物生存壽命的影響。也可考慮採用棉鼠、敘利亞倉鼠、受體人源化動物等開展毒理研究。當然，如果滿足溶瘤病毒在體內正常複製、產生生物活性，非荷瘤普通小鼠也可以選用。

如果是非常規給藥途經，比如肝內動脈給藥，可能選用大動物種屬開展研究更爲合適。

給藥途經和方案應儘可能模擬臨牀應用場景。對於臨牀研究中常用的瘤內注射，正常動物可用肌內或皮下注射的方式來代替。

劑量方面，與小分子（高劑量達到預期臨牀有效暴露量的50倍）和生物藥不同（高劑量達到預期臨牀有效暴露量的10倍），以病毒爲載體的基因治療產品，劑量通常高於臨牀有效劑量即可（For viral vector based gene therapies, doses are typically at or slightly above the clinically efficacious dose）。但是已經上市的溶瘤病毒給藥劑量設計的還是挺高的，比如T-VEC，單次和多次給藥高劑量達到了最高臨牀擬用劑量的60倍，即使藥效試驗的高劑量也達到臨牀擬用劑量的30倍，還是力求充分暴露產品的毒性風險。

6、遺傳毒性和致癌性

標準的遺傳毒性組合試驗和傳統的致癌試驗一般不適用於溶瘤病毒類產品。可在一般毒理研究中伴隨考察產品的致瘤風險。

7、非臨牀package

有個日本團隊對日本、歐洲和美國溶瘤病毒產品首次臨牀試驗之前的非臨牀研究內容要求進行了對比，如下表所示。總體看，各國監管機構對關鍵研究的要求大體是一致的，不一致的估計就高不就低了。

8、案例

T-VEC

T-VEC （ talimogene laherparepvec ），商品名 Imlygic ，由 Amgen 開發， 2015 年被 FDA 批准用於轉移性黑色素瘤的治療。 T-VEC 是以單純皰疹病毒（ herpes simplex virus ， HSV ）爲載體，敲除 HSV-1 中的 ICP34.5 和 ICP47 兩個基因，並在 ICP34.5 基因位置引入 GM-CSF 。與野生型 HSV-1 相比，敲除 ICP34.5 可以使神經毒力降低 10000-1000000 倍。如下圖所示， T-VEC 是將野生型 HSV-1 中的兩個 ICP34.5 全部去除，並以 GM-CSF 代替。而 ICP47 位點的敲除，則可以增加 MHC-Ⅰ 的遞呈，增加病毒和腫瘤抗原的識別，增強 T 細胞免疫。

T-VEC 的作用機制有兩種，一是通過注射在局部腫瘤竈，病毒顆粒感染和殺傷周邊腫瘤細胞，二是腫瘤細胞裂解後釋放腫瘤新生抗原，結合病毒內包含 GM-CSF ，增強系統免疫反應和遠端腫瘤殺傷。

T-VEC 可以通過皮膚、皮下及淋巴結病竈部位進行瘤內注射。臨牀給藥劑量爲，首劑量最多 4*106PFU ， 3 周後給予最多 4*108PFU ，後續每 2 周給予最多 4*108PFU ，具體劑量視腫瘤體積而定。

主要藥效學研究

體外藥理主要研究內容： 1 ）驗證了腫瘤中 US11 的表達（主要與 ICP47 敲除機理相關）； 2 ） ICP47 對 MHC-Ⅰ 表達的影響（還是驗證 ICP47 這個基因位點的功能）； 3 ）在不同細胞對比 T-VEC 與野生 HSV-1 病毒增殖能力； 4 ）對人結腸癌、人胰腺癌、人 / 小鼠肺癌細胞系的細胞毒性研究； 5 ）對人和大鼠前列腺癌細胞裂解能力研究；

體內異源移植瘤模型： HT-29 、 U-87MG 、 Pharynx 三種腫瘤 CDX 模型的安全性及抗腫瘤作用研究；

體內同源腫瘤模型：對 A20 、 CT26 等小鼠同源移植瘤模型的安全性及抗腫瘤作用研究。

藥代動力學研究

1 ） SC 和 IV 單次給藥後 BALB/c 小鼠組織分佈研究

15 只 / 性別 / 組，共 3 組，分別是陰性組、 SC 給藥組和 IV 給藥組，給藥劑量均爲 0.6*107PFU/mL 。分別於給藥後第 24h 、 14 、 28 、 56 、 85 天，處死動物，每個時間點處死 3 只 / 性別 / 組。收集尿液、血液及各組織， qPCR 檢測病毒 DNA 。試驗同時進行了抗 HSV 抗體分析。結果顯示， SC 給藥系統清除需 28 天， IV 給藥需 56 天。

2 ）瘤內注射後小鼠組織分佈研究

A20 接種小鼠後，體積 100mm3 左右分組，瘤內注射 T-VEC ， 50 μ L/ 小鼠， 1*105PFU/mL 、 5*105PFU/mL ， 8 、 14 、 91 三個時間點收集樣本。結果發現， T-VEC 主要在腫瘤、血液和免疫相關組織存在。

3 ） CT26 瘤內注射病毒後“泄露”程度和持續時間研究（結果未見泄露）

4 ） A20 模型瘤內注射病毒後 GM-CSF 水平研究

毒理學研究

1 ） BALB/c 小鼠皮下給藥毒性研究

Non-GLP 研究。 20 只 / 性別 / 組，共 3 組，前兩組給 T-VEC ，劑量分別是 1*106PFU/mL 、 1*107PFU/mL 。第三組給的是 mouse GM-CSF 基因替代的 T-VEC 。第 1 、 4 、 7 、 10 、 13 天右側皮下給藥。 D43 處死動物。未見毒性。

2 ） BALB/c 小鼠重複給藥毒性、組織分佈和 56d 觀察期試驗

試驗偏離太多，如血、尿收集失敗，動物缺水、缺食，供試品不夠，導致後續重新開展的研究。

3 ） BALB/c 小鼠重複給藥毒性、 qPCR 組織分佈和 24h 、 28d 或 56d 觀察期試驗

4 ） BALB/c 小鼠重複給藥毒性、 qPCR 組織分佈和 24 h 、 4 周或 12 周觀察期試驗

5 ） BALB/c 小鼠重複給藥毒性和 24h 或 4 周的觀察期試驗

比較轉入人源 GM-CSF 和鼠源 GM-CSF 的溶瘤病毒安全性區別。

6 ）單次給予雄性 Beagle 犬前列腺的急性毒性試驗

安全性和生物分佈研究

7 ） BALB/c 小鼠靜脈給藥的胚胎 - 胎仔發育毒性試驗

還有些其它研究毒性機制的試驗如雌性 BALB/c 小鼠鼻內給藥的神經毒力試驗，小鼠顱內給藥安全性研究等，不再細表。

Teserpaturev

Teserpaturev 商品名 Delytact Injection ，由日本第一三共開發， 2021 年被日本 PMDA 批准上市，用於惡性膠質瘤的治療。與 T-VEC 類似，也是採用的單純皰疹病毒（ herpes simplex virus ， HSV ）爲載體。敲除 HSV-1 中的 2γ34.5 和 α47 兩個基因，並通過插入來自大腸桿菌的 lacZ 基因失活了 ICP6 基因。 34.5 和 47 兩個位點基因與 HSV-1 在正常細胞的複製相關（ T-VEC 給出的解釋是降低毒力，增強免疫）。 ICP6 失活也是爲了增強腫瘤細胞的選擇性以及抗腫瘤作用。

Delytact 臨牀給藥劑量爲 1 × 109 PFU ，給藥體積爲 1mL ，瘤內注射。首次和第二次給藥間隔 5-14 天，後續間隔 4 周，最多給藥 6 次。

Delytact 作用機理有兩點： 1 ）選擇性在腫瘤細胞複製，並殺傷被感染細胞； 2 ）死掉的腫瘤細胞釋放抗原，進一步激活 T 細胞，增強抗腫瘤免疫反應。邏輯與 T-VEC 類似。

主要藥效學研究

體外藥理： 1 ）人腫瘤細胞體外殺傷活性研究； 2 ）對阿昔洛韋敏感性研究； 3 ）在多種人神經膠質瘤、膠質瘤、頭頸鱗癌、前列腺癌細胞系中的複製研究（提交的文獻數據）； 4 ）對多種人惡性黑色素瘤、人膠質瘤、小鼠神經膠質瘤、人前列腺癌細胞系的殺傷作用研究（提交的文獻數據）； 5 ）在多種人腫瘤細胞系中對 MHC-Ⅰ 表達的影響研究（提交的文獻數據）； 6 ）對腫瘤反應性 T 的刺激作用研究（提交的文獻數據）。

體內藥理： 1 ）人膠質細胞 U87MG 異源移植瘤模型； 2 ）小鼠神經膠質瘤 Neuro2a 同源移植模型； 3 ）人前列腺癌細胞 HONDA 異源移植瘤模型； 4 ）小鼠前列腺癌細胞 TRAMP-C2 同源移植模型； 5 ）小鼠乳腺癌細胞系 M6c 皮下移植和腦內移植瘤模型； 6 ）小鼠自發性乳腺癌模型； 7 ）小鼠自發性 2 型神經纖維瘤模型； 8 ）人神經鞘瘤小鼠異源移植瘤模型。

藥代動力學研究

A/J 小鼠顱內單次給藥生物分佈研究：主要在中樞神經系統分佈。

未開展病毒脫落研究。推測與 HSV-1 病毒脫落背景數據比較多有一定關係。而且與 T-VEC 的改造策略也有相似之處。

毒理學研究

1） 小鼠單次顱內給藥毒性研究。

2 ）未開展重複給藥毒性研究。雖然本品臨牀爲多次給藥，第一三共解釋與給藥途徑是腦實質給藥相關。

3 ）其它毒性評價：整合進染色體風險評估（未開展研究，進行了風險解釋）；成瘤風險評估（未開展研究，進行了風險解釋）；生殖和發育毒性（未開展研究，進行了風險解釋）；局部耐受性（未開展研究，進行了風險解釋）。

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