複方1區 | 遼寧中醫藥大學揭示苓桂術甘湯調節AMPK-FOXO3a通路減輕阿黴素誘導心臟毒性及線粒體損傷

【寫在前面】：本期推薦的是由遼寧中醫藥大學研究團隊近期發表於Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示苓桂術甘湯通過調節AMPK-FOXO3a通路減輕阿黴素誘導的心臟毒性及線粒體損傷。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Linggui Zhugan Decoction ameliorating mitochondrial damage of doxorubicin-induced cardiotoxicity by modulating the AMPK-FOXO3a pathway

【前言】

背景：阿黴素（DOX）是一種廣泛使用的蒽環類化療藥物，對多種惡性腫瘤具有療效。然而，其臨牀應用因劑量依賴性的心臟毒性而受到顯著限制。苓桂術甘湯（LGZGD）是一種傳統中藥方劑，已顯示出顯著的心臟保護作用。然而，其減輕阿黴素誘導的心臟毒性（DIC）的潛力尚未被探索。

目的：本研究旨在探討LGZGD對DIC的保護作用，並探索其通過靶向BTG2調節AMPK-FOXO3a通路以增強線粒體功能的能力。

方法：通過建立斑馬魚DIC模型，評估LGZGD對胚胎和成年斑馬魚的心臟保護作用。進一步的研究包括體外H9c2細胞實驗和體內小鼠模型實驗，以評估LGZGD的藥理作用及其對線粒體功能的影響。通過網絡藥理學和轉錄組學分析預測LGZGD通過BTG2調節AMPK-FOXO3a通路的潛在機制。通過分子對接、分子動力學（MD）模擬和免疫熒光共定位進行驗證。

結果：LGZGD提高了斑馬魚的存活率，並減輕了心臟組織損傷。體外實驗中，LGZGD降低了H9c2細胞中阿黴素誘導的活性氧（ROS）生成，減少了細胞凋亡，改善了線粒體膜電位，並保持了線粒體功能。體內實驗中，LGZGD改善了小鼠的心臟功能，防止了心肌結構損傷。此外，LGZGD減輕了氧化應激、炎症和凋亡，同時逆轉了阿黴素誘導的線粒體結構損傷。網絡藥理學和轉錄組學分析表明，LGZGD調節BTG2基因和AMPK-FOXO3a通路活性。分子對接、MD模擬和免疫熒光共定位支持了LGZGD通過靶向BTG2調節AMPK-FOXO3a通路的假設。

結論：LGZGD通過減少氧化應激、炎症和凋亡，同時保護線粒體結構和功能，對DIC顯示出顯著的心臟保護作用。這些發現爲LGZGD在DIC管理中的臨牀相關性提供了新的見解。靶向BTG2以調節AMPK-FOXO3a通路，突顯了LGZGD作爲一種預防和治療DIC的有前景的治療策略。

（圖文摘要）

【前言】

醫學技術的進步提高了腫瘤治療的效果，增加了患者的生存率和生活質量。然而，治療相關的副作用，尤其是心臟毒性，已成爲一個重要的關注點。化療藥物如阿黴素雖然對實體瘤和血液系統惡性腫瘤有效，但可導致嚴重的心臟急性和慢性損傷，包括心力衰竭。儘管如此，其急性和慢性心臟毒性效應是劑量依賴的，限制了其臨牀應用。隨着人口老齡化和心血管疾病患病率的上升，抗腫瘤治療的心臟毒性影響進一步加劇，成爲癌症患者中非癌症死亡的主要原因之一。目前，唯一獲得FDA批准用於蒽環類藥物誘導的心臟毒性的保護劑——右雷佐生，由於其副作用（如骨髓抑制、肝毒性以及繼發性惡性腫瘤）而受到限制。當前的治療策略大多涉及標準的抗心力衰竭治療，包括β受體阻滯劑和ACE抑制劑，這些方法在管理阿黴素誘導的心臟毒性方面效果有限。因此，開發安全有效的藥理干預措施以解決DIC的需求仍然迫切，這在腫瘤學領域仍是一個關鍵挑戰。苓桂術甘湯憑藉其潛在的心臟保護作用，爲這一領域提供了新的探索方向。

BTG2是B細胞易位基因/BTG家族的成員，在調節細胞增殖、促進細胞凋亡和誘導細胞週期阻滯方面起着關鍵作用。其表達在細胞應激或暴露於基因毒性物質（如電離輻射、紫外線、阿黴素、生長因子、雌激素、白介素-6和環磷酸腺苷）時上調。近期研究表明，BTG2參與了DIC的發生。例如，有研究證明，miR-21可能通過靶向BTG2來減輕DIC。AMPK（AMP激活蛋白激酶）是細胞能量穩態和線粒體功能的關鍵調節因子。研究表明，BTG2通過激活AMPK的表達或活性來增強線粒體功能和細胞代謝，從而發揮其心臟保護作用。叉頭框O3a（FOXO3a）是AMPK的下游靶點，其通過Ser413位點的磷酸化進行調節。AMPK的激活有助於FOXO3a轉移到細胞核，促進能量產生，改善線粒體功能，並減少炎症、細胞凋亡和氧化應激，從而減輕心肌損傷。

綜上所述，這些研究表明BTG2-AMPK-FOXO3a信號軸在調節DIC中發揮着關鍵作用，並可能爲治療提供新的思路。苓桂術甘湯源自張仲景的《傷寒雜病論》，由茯苓、桂枝、白朮和甘草組成。這一經典方劑傳統上用於溫陽、健脾和利水。近期研究已將LGZGD確定爲治療DIC的有效方法。研究表明，LGZGD可增強心臟功能，降低血清中BNP和NT-proBNP水平，抑制心肌間質膠原積累，減少氧化應激，並調節凋亡相關蛋白的表達。其潛在機制被認爲涉及調節Nrf2/BNIP3信號通路。此外，LGZGD通過下調鐵死亡相關通路來保護心肌免受阿黴素誘導的損傷。研究還表明，LGZGD可通過減輕線粒體損傷來改善慢性心力衰竭和心肌梗死。儘管已有這些令人鼓舞的發現，但LGZGD通過BTG2-AMPK-FOXO3a信號軸增強能量代謝和逆轉線粒體損傷的潛力尚未被報道。本研究通過探討LGZGD對BTG2-AMPK-FOXO3a通路的調節作用，研究其心臟保護效應。利用心肌細胞、斑馬魚和小鼠模型，本研究旨在闡明LGZGD減輕阿黴素誘導的心臟毒性的機制，爲其在DIC預防和治療中的應用提供科學依據。

【結果】

1. LGZGD在斑馬魚模型中對DIC的改善作用

研究表明，LGZGD能夠顯著減輕阿黴素誘導的斑馬魚胚胎和成年斑馬魚的心臟毒性。在斑馬魚胚胎模型中，阿黴素導致心包水腫、心房變薄、心室扭曲和心肌纖維紊亂等病理變化，而LGZGD能夠顯著緩解這些異常，恢復心臟結構和功能。此外，LGZGD還通過減輕氧化應激、炎症反應和細胞凋亡，改善阿黴素誘導的心肌細胞損傷。

2. LGZGD對心肌細胞損傷的保護作用

在體外實驗中，LGZGD顯著降低了阿黴素誘導的心肌細胞（H9c2細胞）的氧化應激和炎症反應。研究表明，LGZGD能夠減少活性氧（ROS）的積累，抑制促炎細胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）的釋放，並通過調節抗氧化酶（如GSH和SOD）的活性來減輕氧化損傷。

3. LGZGD對線粒體損傷的改善作用

LGZGD能夠通過調節AMPK-FOXO3a信號通路來減輕阿黴素誘導的線粒體損傷。研究發現，LGZGD通過靶向BTG2基因，激活AMPK表達或活性，從而改善線粒體功能，減少線粒體的形態異常和功能障礙。

4. LGZGD對小鼠DIC的保護作用

在小鼠模型中，LGZGD顯著改善了阿黴素誘導的心臟功能障礙，減輕了心肌纖維紊亂、膠原沉積和炎症細胞浸潤等病理變化。此外，LGZGD還通過降低血清中LDH、CK-MB、cTnI和cTnT的水平，進一步證實了其對心肌損傷的保護作用。

5. LGZGD的作用機制

研究表明，LGZGD通過調節BTG2-AMPK-FOXO3a信號軸，改善線粒體功能，減輕氧化應激和炎症反應，從而發揮心臟保護作用。此外，LGZGD還通過減少心肌細胞凋亡（通過TUNEL染色評估）和調節氧化應激標誌物（如MDA和SOD）來減輕心肌損傷。

線粒體是活性氧（ROS）生成的主要場所，在細胞能量代謝中起着核心作用。爲了評估LGZGD對阿黴素誘導的線粒體損傷的影響，我們通過透射電子顯微鏡檢查了心臟組織的亞細胞結構。在阿黴素處理的小鼠中，心肌細胞表現出顯著的線粒體異常，包括嵴斷裂、收縮、局竈性空泡化以及線粒體密度顯著減少。LGZGD處理則保留了線粒體結構，增加了線粒體含量，並改善了結構完整性，顯示出對阿黴素誘導的線粒體損傷的保護作用。

6. LGZGD的入血成分分析和網絡藥理學分析

爲了闡明LGZGD治療DIC的藥效學基礎和分子機制，我們對其成分進行了全面分析。通過UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析，我們識別了LGZGD的成分及其入血成分。在155種被鑑定的成分中，有37種被歸類爲血中成分。這些成分可能是LGZGD治療DIC的活性成分。

通過網絡藥理學，我們預測了LGZGD的潛在治療靶點。在LGZGD的血中成分中，有512個靶點與之相關，而與DIC相關的靶點有167個。其中，46個靶點重疊。通過Cytoscape軟件構建的藥物-成分-靶點網絡顯示，甘草、桂枝、茯苓和白朮的血中成分分別用不同顏色的圓圈表示。核心成分包括甘草素、甘草苷等。

7. 轉錄組學分析揭示了LGZGD治療DIC的關鍵信號通路

轉錄組學被用來研究LGZGD干預後心髒組織中的差異基因表達，揭示了其治療DIC的潛在機制。與對照組相比，模型組中有105個差異基因，其中53個上調，52個下調。LGZGD處理改變了29個基因的表達。基因本體（GO）分析顯示，LGZGD相關生物過程主要涉及行爲反應、生物調節、細胞組織或生物發生以及細胞組成。分子功能主要包括結合、催化活性、分子轉導活性、結構分子活性、運輸活性和抗氧化活性等。KEGG富集分析顯示，LGZGD影響的途徑包括細胞色素P450的藥物代謝、脂肪酸代謝、PPAR信號通路、AMPK信號通路和PI3K-Akt信號通路。

8. LGZGD在體內調節BTG2和AMPK-FOXO3a信號通路的活性

基於網絡藥理學和轉錄組學，AMPK-FOXO3a信號通路被認爲是LGZGD治療效果的關鍵機制。在29個差異表達基因中，BTG2（AMPK-FOXO3a信號通路的關鍵調節因子）在LGZGD處理後表達顯著降低。實時RT-PCR結果顯示，模型組中BTG2 mRNA表達顯著升高，而AMPK和FOXO3a mRNA表達顯著降低。LGZGD處理則逆轉了這些趨勢。在蛋白水平上，模型組中BTG2表達顯著升高，而p-AMPK/AMPK和p-FOXO3a/FOXO3a比率顯著降低。LGZGD處理則顯著降低了BTG2蛋白表達，同時顯著增加了p-AMPK/AMPK和p-FOXO3a/FOXO3a水平。這些發現表明，LGZGD通過下調BTG2蛋白表達和增強AMPK-FOXO3a信號通路的激活來減輕DIC，從而減輕心肌損傷。

9. 分子對接和MD驗證了LGZGD的靶點

網絡藥理學和轉錄組學分析表明，AMPK和FOXO信號通路可能是LGZGD減輕DIC的關鍵靶點。AMPK是細胞能量穩態的關鍵調節因子，激活後可增強線粒體功能，從而發揮心臟保護作用。FOXO是AMPK的下游靶點，在線粒體動態和自噬穩態中起關鍵作用。AMPK激活調節FOXO3a在Ser413位點的磷酸化，促進其核轉位。這一級聯反應促進能量產生，恢復線粒體功能，並減輕心肌損傷。此外，轉錄組學分析顯示，LGZGD干預後心髒組織中BTG2的表達顯著降低。高BTG2表達可能通過抑制AMPK和FOXO3a活性，損害線粒體功能，加劇心肌損傷。基於這些發現，LGZGD似乎通過調節BTG2來靶向AMPK-FOXO3a通路，發揮治療效果。爲了進一步探索LGZGD與BTG2之間的相互作用，進行了分子對接模擬。選擇LGZGD的8種核心成分（包括甘草素、甘草苷等）進行分析。這些化合物與BTG2之間存在強相互作用。其中，甘草苷A與BTG2的結合能最低，使其成爲進一步研究的最有希望的候選物。

我們驗證了LGZGD通過BTG2調節AMPK-FOXO3a通路從而改善DIC的假設。BTG2與AMPK之間的分子對接顯示了強結合相互作用。心臟組織的免疫熒光染色進一步證實了BTG2和AMPK的共定位。這些發現初步表明BTG2可以直接與AMPK結合併發揮調節作用，支持我們關於LGZGD通過BTG2激活AMPK-FOXO3a通路來改善DIC的結論。

【總結】

本研究發現，LGZGD能夠有效抑制阿黴素（DOX）誘導的心臟毒性（DIC），具體表現爲減輕氧化應激、炎症反應、細胞凋亡以及改善線粒體結構和功能的損傷，從而顯著改善心臟功能。初步證據表明，LGZGD的關鍵成分可能通過多靶點、多通路機制發揮作用，其中BTG2介導的AMPK-FOXO3a通路可能是其重要機制之一。該通路通過逆轉線粒體損傷，緩解DIC相關的病理症狀。

AMPK-FOXO3a通路在能量代謝、細胞應激反應和線粒體穩態中具有關鍵作用，而BTG2作爲該通路中的潛在關鍵調節因子，其在心臟保護和通路調節中的作用仍需進一步探索。深入研究這一信號軸，有望爲揭示DIC的發病機制提供新的見解，併爲LGZGD的心臟保護機制提供新的理論依據。

然而，本研究存在侷限性：未使用與BTG2/AMPK-FOXO3a通路相關的激活劑、抑制劑或基因敲除小鼠來驗證其機制，且LGZGD的具體活性單體成分尚不明確。因此，未來研究應聚焦於以下方向：

1. 探討BTG2在DIC中的作用及其對AMPK-FOXO3a通路的調節機制。

2. 闡明LGZGD的關鍵活性成分，並評估其在DIC中的藥理作用。

總之，本研究爲DIC的防治提供了新的思路，但需要進一步的機制研究和實驗驗證。

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